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样本取材：组织离体后，应迅速转移至装有预冷组织保存液的样本管中，保持低温（2-8℃）转运至实验室。

试剂准备：将基质胶置于4℃冰箱过夜或置于冰上使其完全融解。肠癌类器官培养基提前从冰箱取出，恢复至室温备用。

初步清洗：在生物安全柜中，将组织转移至含20 mL预冷DPBS的50 mL离心管中，浸泡10分钟。弃去上清，重复此步骤2-3次。

组织处理：将组织转移至无菌培养皿中，使用无菌手术刀与镊子，彻底去除表面杂质。随后将组织剪碎（直径约0.5 mm–1 mm）。

组织消化：向组织块中加入10 mL预热的组织消化液，充分摇匀。置于37℃培养箱中消化20-40分钟。期间可每隔10分钟取样在显微镜下观察，待组织块明显分散、悬液变浑浊时即可终止消化。

终止消化：加入20 mL DPBS（约2倍体积）以终止消化。使用润洗过的移液器或吸管，反复吹打悬液，直至无明显大块组织残留。

细胞收集：用润洗液润洗100 μm细胞筛网及一个新的50 mL收集管。将消化后的细胞悬液通过筛网过滤至收集管中。向原消化管中再次加入DPBS吹打残留组织，并再次过滤，合并滤液，最后用DPBS将总体积定容至40 mL。

图2：类器官培养系统

离心富集：将细胞悬液在4℃条件下，以300 ×g离心5分钟。小心弃去上清，保留细胞沉淀。

红细胞裂解（可选）：若沉淀中有大量红细胞，可加入2-5 mL红细胞裂解液重悬细胞，室温静置1-2分钟，随后加入过量DPBS终止裂解，并再次以300 ×g离心5分钟。

清洗与重悬：用5 mL DPBS重悬细胞沉淀，再次离心弃上清。

细胞计数：向最终的细胞沉淀中加入1 mL DPBS重悬，取适量悬液使用细胞计数仪进行计数，计算总细胞数及活率。

调整浓度：根据计数结果，使用DPBS将细胞悬液体积调整至5 mL，再次离心弃上清，获得浓缩的细胞沉淀。

基质胶混合：用预冷的移液器吸头，将预冷的基质胶与细胞沉淀轻柔混匀，最终将细胞密度调整至每微升基质胶含100-1000个细胞/细胞团。注意操作应轻柔迅速，避免产生气泡。

接种：立即使用预冷的吸头，吸取50 μL细胞-基质胶混合液，滴加于24孔板孔底中央。确保液滴圆整，不与孔壁接触。

胶体凝固：将培养板转移至37℃、5% CO₂培养箱中，静置孵育15-30分钟，使基质胶完全凝固。

添加培养基：孵育结束后，沿每孔侧壁缓慢加入500 μL已恢复至室温的类器官完全培养基，避免冲散基质胶滴。

培养与观察：将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。每2-3天更换一次新鲜培养基，并每天在显微镜下观察类器官的形成、形态与生长状态。